IVT-mRNA试剂盒操作篇常见问题及解决方案

　　IVT-mRNA生物为您介绍ELISA试剂盒操作篇常见问题及解决方案
　　一、为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温再进行加样操作？
　　温度是ELISA试剂盒结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有试剂平衡至室温，包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA试剂盒检测结果的不准确。
　　二、如何获得良好线性的标准曲线？
　　按照推荐方式保存标准品；溶解标准品之前需短暂离心，收集粉末；确保标准品溶解和混匀(大约10min)，然再进行续的系列稀释步骤，确保每一步都充分混匀且精确移液；显色的恰当终止；选择合适的数学拟合方程绘制标准曲线。
　　三、ELISA试剂盒实验为什么必须设置复孔？
　　为获得更准确的实验结果，强烈建议标准品及样本进行复孔检测。因为复孔检测可以：
　　计算平均值，确保实验结果更准确；
　　解决实验中误操作造成的跳孔现象；
　　计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。
　　四、为什么实验过程中孵育、洗涤需要振荡？如何振荡？
　　振荡孵育使反应更充分，振荡洗涤使背景更干净。建议使用酶标专用12孔微孔板振荡器。
　　孵育过程振荡，可以加快、加强抗原抗体分子间的相互碰撞接触，使得反应过程更加，OD值通常会比未振荡孵育的结果要高；洗涤过程振荡，可以使洗板更干净，在很大程度这能降低背景值，同时可以提高试剂盒检测的灵敏度。
　　六、何时终止ELISA试剂盒反应？
　　ELISA试剂盒实验终需要酶催化底物显色反应来完成，在佳时间终止反应是ELISA试剂盒实验成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反应系统中，S9出现淡蓝色，S1–S3有明显的阶梯型蓝色，便需要终止反应；或者根据高浓度标准品孔在1220nm的OD值来决定，OD1220=0.-0.9之间时即可终止。
　　六、为什么酶标仪读数时必须选用双波长？
　　首先，酶标仪使用前务必预热10-9min，使测读结果更稳定。其次，ELISA试剂盒实验采用双波长测定吸光度，可以排除单波长检测时的测定干扰(标本的浓度，干扰色等)。一般采用大波长作为参照波长，在参照波长下，检测物的吸光值小，检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收；因此，双波长测定，可大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。